Apr 30, 2024
Le lipoproteine del liquido cerebrospinale inibiscono α
Neurodegenerazione molecolare volume 18, Numero articolo: 20 (2023) Cita questo articolo 2110 Accessi 3 Citazioni 24 Dettagli metriche alternative L'aggregazione di α-sinucleina (α-syn) è una caratteristica importante di
Neurodegenerazione molecolare volume 18, numero articolo: 20 (2023) Citare questo articolo
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L'aggregazione di α-sinucleina (α-syn) è una caratteristica importante della malattia di Parkinson (PD) e di altre sinucleinopatie. Attualmente, i test di amplificazione dei semi α-syn (SAA) utilizzando il liquido cerebrospinale (CSF) rappresentano gli strumenti diagnostici più promettenti per le sinucleinopatie. Tuttavia, il liquido cerebrospinale stesso contiene diversi composti che possono modulare l’aggregazione di α-syn in modo paziente-dipendente, minando potenzialmente gli SAA α-syn non ottimizzati e impedendo la quantificazione dei seed.
In questo studio, abbiamo caratterizzato l'effetto inibitorio dell'ambiente del liquido cerebrospinale sul rilevamento degli aggregati α-syn mediante frazionamento del liquido cerebrospinale, spettrometria di massa, test immunologici, microscopia elettronica a trasmissione, spettroscopia di risonanza magnetica nucleare in soluzione, una SAA diagnostica altamente accurata e standardizzata e diversi condizioni di aggregazione in vitro per valutare l'aggregazione spontanea di α-syn.
Abbiamo scoperto che la frazione ad alto peso molecolare del liquido cerebrospinale (> 100.000 Da) è altamente inibitoria sull'aggregazione α-syn e abbiamo identificato le lipoproteine come i principali fattori di questo effetto. L'interazione diretta tra lipoproteine e α-syn monomerica non è stata rilevata mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare in soluzione, d'altra parte abbiamo osservato complessi lipoproteina-α-syn mediante microscopia elettronica a trasmissione. Queste osservazioni sono compatibili con l’ipotesi di un’interazione tra lipoproteine e intermedi α-syn oligomerici/proto-fibrillari. Abbiamo osservato un'amplificazione significativamente più lenta dei semi α-syn nel liquido cerebrospinale del PD quando le lipoproteine sono state aggiunte alla miscela di reazione della SAA diagnostica. Inoltre, abbiamo osservato una ridotta capacità di inibizione del liquido cerebrospinale sull'aggregazione α-syn dopo aver immunodepletato ApoA1 e ApoE. Infine, abbiamo osservato che i livelli di ApoA1 e ApoE nel liquido cerebrospinale erano significativamente correlati ai parametri cinetici SAA in n = 31 campioni di liquido cerebrospinale di controllo SAA-negativi arricchiti con aggregati α-syn preformati.
I nostri risultati descrivono una nuova interazione tra lipoproteine e aggregati α-syn che inibisce la formazione di fibrille α-syn e potrebbe avere implicazioni rilevanti. In effetti, l’inibizione specifica del donatore del liquido cerebrospinale sull’aggregazione delle α-sine spiega la mancanza di risultati quantitativi dall’analisi dei parametri cinetici derivati dalla SAA fino ad oggi. Inoltre, i nostri dati mostrano che le lipoproteine sono i principali componenti inibitori del liquido cerebrospinale, suggerendo che le misurazioni della concentrazione di lipoproteine potrebbero essere incorporate nei modelli di analisi dei dati per eliminare gli effetti confondenti dell’ambiente del liquido cerebrospinale sugli sforzi di quantificazione delle α-sintesi.
La malattia di Parkinson (PD), la demenza a corpi di Lewy (DLB) e l'atrofia multisistemica (MSA) sono malattie neurodegenerative caratterizzate patologicamente dalla presenza di inclusioni α-syn intracellulari in regioni vulnerabili del cervello e sono comunemente chiamate sinucleinopatie. I test di amplificazione dei semi (SAA), noti come amplificazione ciclica di misfolding proteico (PMCA) [1] e conversione indotta da quaking in tempo reale (RT-QuIC) [2] nel campo dei prioni, sono stati recentemente adattati per rilevare aggregati α-syn nei fluidi e nei tessuti biologici umani e potrebbe migliorare significativamente la diagnosi delle sinucleinopatie nel prossimo futuro. Gli SAA si basano sull'amplificazione di piccole quantità di aggregati α-syn simili a prioni (semi α-syn) presenti in matrici biologiche, che si propagano in vitro reclutando monomeri α-syn ricombinanti aggiunti attraverso cicli di allungamento e frammentazione [3, 4 ]. Il processo di amplificazione viene monitorato utilizzando la tioflavina-T (ThT), un colorante fluorescente che si lega con elevata affinità ai motivi dei fogli β incrociati degli aggregati amiloidi. Sorprendentemente, gli SAA hanno rilevato i semi di α-syn nel liquido cerebrospinale da casi di PD prodromico [5, 6], raggiungendo una sensibilità simile a quella dei pazienti con malattia conclamata [7,8,9]. I rapporti iniziali hanno mostrato correlazioni tra la velocità di aggregazione e sia la progressione della malattia (punteggio H&Y) [1] sia i livelli di aggregati α-syn sintetici aumentati nel liquido cerebrospinale [1, 7]. Tuttavia, questi risultati non sono stati replicati analizzando coorti più grandi, [9, 10] e la semi-quantificazione mediante diluizioni seriali non era nemmeno correlata alla progressione della malattia [7, 9]. È stato osservato che il liquido cerebrospinale sia dei controlli sani (HC) che dei casi di sinucleinopatia inibisce l'aggregazione α-syn rispetto al solo tampone [1, 11,12,13]. Di conseguenza, i protocolli SAA includono la diluizione del liquido cerebrospinale per superare l’inibizione e consentire un’amplificazione efficiente dei semi α-syn [2, 11]. Questo effetto è stato osservato più volte ma, sorprendentemente, non è stato ancora caratterizzato. In effetti, gli effetti del liquido cerebrospinale sull’aggregazione delle α-syn possono spiegare l’apparente mancanza di correlazione tra i parametri del test con la progressione della malattia e il carico di α-syn [9, 10].
100 kDa CSF fraction in PBS. The residues experiencing the largest decreases in signal intensity (smaller by one or more standard deviations with respect to the average value) are highlighted in light blue. The intensity ratios corresponding to overlapping peaks are highlighted in red (their values were not considered in the calculation of the average decreases and standard deviations). Fig. S5. CSF pH drift. The pH change due to the exposure of CSF to air was monitored over time in 500 μL of undiluted pooled CSF (A) and in the presence of PBS (400 μL CSF + 200 μL PBS 3x) in polypropylene vials with a Thermo Scientific Orion pH-meter equipped with a glass 6 mm diameter pHenomenal MIC 220 Micro electrode. Right before each measurement, the sample was vortexed for 20 sec and left open to air for another 20 sec. Fig. S6. Different CSF fractions differently affect α-syn aggregation. Mean fitted t2 parameters of samples with 40 μl of PBS/CSF fractions. The values displayed result from the average of three replicates with error bars reflecting the SEM. For whole CSF and the >100 kDa fraction the total duration of the experiment is shown due to the absence of appreciable aggregation. Fig. S7. Raw images of the dot-blot assays. A-B) Native images of the dot-blot assay performed on α-syn alone replicates at different timepoints with OC (A) and A11 (B) conformational antibodies. C-D) Native image of the dot-blot assay performed on the HSA and HDL containing samples with OC (C) and A11 (D) conformational antibodies. Fig. S8. WB experiments to track α-syn aggregation in the presence of human HDL. A) α-Syn aggregation patterns in samples collected at different timepoints of the spontaneous aggregation process, was monitored by WB using Syn211 antibody (4-20% SDS-PAGE, 2 μg protein loaded). Monomeric α-syn decreases as t increases due to the formation of fibrils. B) In a similar way, a WB with Syn211 was performed on the reaction products obtained after 180 h, at different HDL concentrations with and without α-syn (exposure time 210 s). C) The experiment was then repeated by doubling the amount of sample loaded into the gel to better highlight the presence of oligomeric species (exposure time 30 s). Under these conditions, chosen to better visualize the signal at 150-200 kDa, the α-syn monomer bands at 1 and 0.3 mg/mL HDL may not quantitively reflect monomer concentration (overloaded lanes). Fig. S9. Representative TEM images of α-syn incubated with CSF. Representative TEM images obtained by analyzing samples obtained by the co-incubation of α-syn 0.7 mg/mL at 37 °C with pooled human CSF (1:5 ratio with respect to total reaction volume). Samples were subjected to cycles of incubation (13 min) and shaking (double-orbital, 2 min) at 500 rpm. Fig. S10. NMR titrations of α-syn with HDL, LDL and TTR. A) Intensity decreases of the signals of two-dimensional (2D) 15N–1H HSQC experiments acquired at 950 MHz at T = 283 K on 15N labelled α-syn (100 μM) in PBS after the addition of 0.57 mg/mL serum-derived HDL. The intensity ratios corresponding to overlapping peaks are highlighted in red. B) Intensity decreases of the signals of two-dimensional (2D) 15N–1H HSQC experiments acquired at 950 MHz at T = 283 K on 15N labelled α-syn (100 μM) in PBS after the addition of 1 mg/mL serum-derived LDL. C) Intensity decreases of the signals of two-dimensional (2D) 15N–1H HSQC experiments acquired at 950 MHz at T = 283 K on 15N labelled α-syn (100 μM) in PBS after the addition of 3 mg/mL TTR. Fig. S11. WB experiments performed on immunodepleted CSF. WB experiments were performed with anti-ApoA1 (MIA1404) and anti-ApoE (PA5-27088) antibodies on neat CSF and supernatants (400 μL CSF, 100 μL slurry) resulting from immunoprecipitation procedure performed using different quantities of the same antibodies (IP CSF samples), immunoprecipitation performed without antibodies (CSF IP no Ab). The conditions relative to IP CSF ApoA1 60 µg and IP CSF ApoE 20 µg were then selected for Protein aggregation assays. Table S1. Concentration factors and final volumes of the CSF fractions./p>