Language
Una perla

Blog

CasaCasa / Blog / Una perla
search

Aug 05, 2023

6K Energy implementerà le apparecchiature Forge Nano per la produzione commerciale di catodi NMC 811

May 29, 2024

Una perla

Feb 14, 2024

Informazioni sulla sovvenzione per le infrastrutture per i liquami, chi può presentare domanda e cosa può pagare

Nov 13, 2023

Soluzioni di rettifica avanzate alla EMO 2023

Jun 11, 2024

Allenamento aerobico e microbioma intestinale

Invia la tua richiesta
INVIA

May 29, 2024

Una perla

Communications Biology volume 5, Numero articolo: 1206 (2022) Cita questo articolo 3909 Accessi 4 Dettagli metriche altmetriche Analisi della fosforilazione guidata dall'agonista dei recettori accoppiati a proteine ​​G

Biologia delle comunicazioni volume 5, numero articolo: 1206 (2022) Citare questo articolo

3909 Accessi

4 Altmetrico

Dettagli sulle metriche

L'analisi della fosforilazione guidata dall'agonista dei recettori accoppiati a proteine ​​G (GPCR) può fornire preziose informazioni sullo stato di attivazione del recettore e sulla farmacologia del ligando. Tuttavia, fino ad oggi, la valutazione della fosforilazione dei GPCR utilizzando applicazioni ad alto rendimento è stata impegnativa. Abbiamo sviluppato e convalidato un test immunologico basato su microsfere per la valutazione quantitativa della fosforilazione GPCR indotta da agonisti che può essere eseguito interamente in piastre di coltura cellulare multipozzetto. Il test prevede l'immunoprecipitazione dei recettori marcati per affinità utilizzando biglie magnetiche seguita dal rilevamento delle proteine ​​utilizzando anticorpi anti-GPCR specifici dello stato di fosforilazione e indipendenti dallo stato di fosforilazione. Come prova del concetto, cinque GPCR prototipici (MOP, C5a1, D1, SST2, CB2) sono stati trattati con diversi agonisti e antagonisti e sono state generate curve concentrazione-risposta. Abbiamo quindi esteso il nostro approccio per stabilire test selettivi sugli inibitori della chinasi GPCR cellulare (GRK), che hanno portato alla rapida identificazione di un inibitore selettivo di GRK5/6 (LDC8988) e di un inibitore pan-GRK altamente potente (LDC9728). In conclusione, questo versatile test di fosforilazione GPCR può essere ampiamente utilizzato per la profilazione dei ligandi e lo screening degli inibitori.

I recettori accoppiati a proteine ​​G (GPCR) sono trasduttori di segnale vitali che mediano gli effetti di una varietà di stimoli chimici e fisici e rappresentano i principali bersagli farmacologici per molte malattie umane. I GPCR hanno una struttura uniforme con domini a sette transmembrana e sono quindi indicati anche come recettori a sette transmembrana (7TMR). L'attivazione da parte dei loro ligandi endogeni o agonisti esogeni porta a cambiamenti conformazionali dei GPCR riconosciuti da una famiglia di chinasi chiamate recettori chinasi accoppiati a proteine ​​G (GRK)1. La capacità unica delle GRK di riconoscere i recettori attivati ​​determina la fosforilazione agonista-dipendente nei residui intracellulari di serina e treonina2,3. Inoltre, anche le chinasi regolate da secondi messaggeri possono partecipare alla fosforilazione dei GPCR, comprese le proteine ​​chinasi A e C e altre serina/treonina chinasi4,5,6. La fosforilazione dei GPCR è un processo biologicamente e farmacologicamente importante che avvia principalmente la desensibilizzazione e l'internalizzazione di un recettore7,8. La fosforilazione aumenta anche l'interazione dei GPCR con le proteine ​​adattatrici intracellulari come le β-arrestine, che possono innescare una seconda ondata di segnalazione9,10,11,12.

Gli studi iniziali sul GPCR erano basati su test di fosforilazione radioattiva di cellule intere, che richiedono elevati livelli di radioattività e non possono essere utilizzati per identificare singoli residui di serina e treonina fosforilata. Successivamente gli studi si sono indirizzati verso l'analisi fosfoproteomica, attraverso la quale si sono ottenute limitate informazioni quantitative13. Attualmente, l'approccio prevalente si basa su anticorpi che riconoscono specificamente lo stato fosforilato di un GPCR14,15,16,17,18. Quando disponibili, gli anticorpi anti-GPCR specifici per il fosfosito sono strumenti eccellenti per risolvere le dinamiche temporali e spaziali della fosforilazione dei recettori, identificare chinasi e fosfatasi rilevanti, rilevare l'attivazione dei recettori e profilare le proprietà farmacologiche di nuovi ligandi19,20,21,22. Tuttavia, gli anticorpi specifici per il fosfosito vengono utilizzati prevalentemente negli approcci di immunoblotting che sono tecnicamente impegnativi, limitati a campioni di piccole dimensioni e difficili da quantificare.

Nella ricerca farmaceutica e accademica, sono spesso necessari test ad alto rendimento per facilitare lo screening di grandi librerie chimiche. Sebbene il legame con i recettori, la segnalazione delle proteine ​​G e il reclutamento dell'arrestina possano essere valutati con le metodologie disponibili, attualmente non sono disponibili tecnologie adeguate per la determinazione della fosforilazione dei GPCR. Siamo stati quindi motivati ​​a sfruttare gli anticorpi anti-GPCR specifici del fosfosito nello sviluppo di un test immunologico quantitativo di fosforilazione che può essere eseguito interamente in piastre di coltura cellulare multipozzetto e favorisce applicazioni a produttività medio-alta (Fig. 1). Poiché questo test può essere adattato praticamente a tutti i recettori a sette transmembrana, viene denominato "test di fosforilazione 7TM".

95% confluency. The cells were cultured in the presence or absence of the agonist [D-Ala2,N-MePhe4,Gly-ol]-enkephalin (DAMGO) and then lysed in detergent buffer containing protease and protein phosphatase (PPase) inhibitors. After plate centrifugation, lysates were transferred to U-bottom 96-well plates. MOPs were then immunoprecipitated using mouse anti-HA antibody-coated magnetic beads. After washing the beads under magnetic force, either phosphosite-specific rabbit antibodies that specifically recognized the S375-phosphorylated form of MOP (pS375-MOP) or antibodies that detected MOP in a phosphorylation-independent manner (np-MOP) were added to the cells (Fig. 2a). Primary antibody binding was then detected using commercially available enzyme-labeled secondary antibodies followed by addition of the respective enzyme substrate solution. The color reaction in DAMGO-treated wells was stopped when the optical density (OD) read at 405 nm reached 1.2, typically within 2 to 8 min. Under identical conditions, the OD of untreated wells was approximately 0.2, suggesting that DAMGO-induced S375 phosphorylation of MOP was specifically detected within the optimal dynamic range for 2′-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid (ABTS)-based enzyme immunoassay substrates (Fig. 2b). Omission of the magnetic beads or the primary or secondary antibodies or the use of untransfected cells resulted in OD readings of 0.2 or less. When DAMGO was added at different concentrations ranging from 10 nM to 10 µM in wells assayed using the anti-pS375-MOP antibody, we observed increasing OD readings with data points following the typical shape of a sigmoidal concentration–response curve (Fig. 2c). In contrast, all wells assayed using the anti-np-MOP antibody yielded an OD reading of ~0.8, independent of agonist exposure, indicating that all the MOPs had been identified (Fig. 2c). Next, we evaluated the effect of PPase inhibitors with both a pS375-MOP phosphorylation immunoassay and western blot assay with cells cultured in a multiwell plate. For the western blot analysis, cells were cultured and treated in 96-well plates as described and lysed in detergent buffer with or without PPase inhibitors. MOPs were immunoprecipitated with anti-HA magnetic beads. Immunoprecipitates were washed under magnetic force, and receptors were eluted from the beads into SDS-sample buffer by incubating the plates for 25 min at 43 °C. When these samples were immunoblotted with the anti-pS375-MOP antibody, a concentration-dependent increase in S375 phosphorylation was observed in samples cultured with PPase inhibitors but not in samples lysed without PPase inhibitors (Fig. 2d, top panel). When the blot was stripped and reprobed with the np-MOP antibody, similar levels of MOPs were detected in all the samples irrespective of the presence of PPase inhibitors or agonist exposure (Fig. 2d, bottom panel). For the in-well assay, cells were plated and grown, treated and lysed as in the western blot assay, except that the samples were directly immunoassayed in the plate. Similar to the results obtained by immunoblotting, the results of the assay performed with the anti-pS375-MOP antibody revealed a concentration-dependent increase in signal intensity only in the wells with PPase inhibitor-treated samples (Fig. 2e). In contrast, in wells assayed with the anti-np-MOP antibody, similar signals were observed independent of inhibitor or agonist treatment (Fig. 2f). Notably, a high degree of correlation between the concentration–response curves obtained through the immunoblot analysis and immunoassay was found (Supplementary Fig. 1). These results show that the addition of PPase inhibitors during cell lysis was an essential component of the assay. These results also show that anti-pS375-MOP antibody binding depended on agonist-induced receptor phosphorylation, which needed to be protected from PPase digestion during cell lysis. The anti-np-MOP antibody bound to receptors regardless of their phosphorylation status, and hence, using this antibody appeared to be a feasible means of controlling total receptor content./p>